Зміст
- етапи
- Спосіб 1 Визначте бактерію за плямою Грама
- Спосіб 2 Виконайте тест на фарбування Зюля-Нельсена
- Метод 3 Вивчення поведінки та зовнішнього вигляду бактерій
- Спосіб 4 Інтерпретуйте всі результати
Ідентифікація бактерій є складним завданням. Однією з причин є те, що, за підрахунками, у світі налічується від 10 000 до 1 мільярда видів бактерій! Правильна ідентифікація бактерій є дуже важливою, особливо в галузі медицини, де правильне лікування захворювання багато в чому залежить від типу мікроба, який викликає проблему. У більшості випадків ідентифікація проводиться на основі усунення. Для виявлення бактерії необхідно провести фарбування тестів, проаналізувати її зовнішній вигляд і спостерігати, як вона добре реагує на різні умови. Якщо вам потрібен швидкий результат, візьміть пробу ДНК, щоб відправити в лабораторію.
етапи
Спосіб 1 Визначте бактерію за плямою Грама
- визначити якщо бактерії грам позитивні чи негативні. Фарбування грамом - це спосіб поділу бактерій між двома найпоширенішими типами: грампозитивними та грамнегативними. Перші мають товсту клітинну стінку, що складається з полімеру під назвою пептидоглікан, який найкраще фарбує як тонкі стінки грамнегативних бактерій.
- Деякі поширені типи грампозитивних бактерій - це стрептококи, стафілококи, мікрококи (або мікрококи) та лістерії.
- Ось кілька поширених прикладів грамнегативних бактерій: Neisseria, Acinetobacter, Moraxella, Enterobacteriaceae, Vibrio, Haemophilus, Fusobacterium і Campylobacter.
- Вживайте відповідних захисних заходів. Бактерії та хімічні елементи, які ви будете використовувати під час тесту, становлять небезпеку для вашого здоров’я. Носіть захисні окуляри, одноразові нітрилові рукавички та лабораторну шубу під час проведення тесту на фарбування. Після закінчення покладіть рукавички та всі інші забруднені матеріали в спеціальний пакет. Не забудьте дотримуватися процедур вашої лабораторії, щоб позбутися мішка із забрудненими продуктами.
- Помістіть зразок для спостереження на предметне скло. Для початку тесту помістіть краплю або бактеріальний зразок на стерильний предмет. Потім просуньте лезо над запаленим пальцем Bunsen три рази, щоб закріпити зразок і не допустити його виходу з тарілки, коли ви промиєте або додаєте реагенти.
- Додайте до леза 5 крапель фіолетового кристала. На пробу вилити п’ять крапель кристалічного фіолетового розчину. Зачекайте хвилину, щоб зразок поглинув кришталеву фіалку.
- Тримайте лезо на місці шпильками для одягу, щоб не заплямувати руки.
- Ретельно вимийте лезо, щоб видалити пляму. Скористайтеся краном або пляшкою для віджимання і дайте воді дуже повільно протікати до п'яти секунд, щоб видалити залишки чорнила, які не прилипали до зразка.
- На гірку вилийте п’ять крапель грам-діода. Це розчин, що складається з діода, бікарбонату натрію та діодиду калію, який змушує кристал фіалки плавитися з клітинними стінками бактерій. Налийте п’ять крапель розчину на зразок і залиште на одну хвилину.
- Пробу промити спиртом або молочною кислотою. Алкоголь і лацетон є відбілюючими засобами і усунуть фарбування бактеріальної стінки клітин, якщо вони є грамнегативними. На зразок вилийте кілька крапель відбілювача і дайте йому діяти не більше трьох секунд. Після цього спробуйте обережно промити водою протягом п’яти секунд, щоб видалити ці відбілюючі засоби.
- Якщо дозволити відбілювачу тривалий час працювати, це може призвести до зникнення плям грампозитивних бактерій, що призведе до помилкового негативу.
- Проведіть контрастний тест із сафранином. Сафранін - це червоний барвник, який контрастує з кришталевим фіолетовим, тим самим забарвлюючи бактерії, не уражені фіолетовим забарвленням. На пробу вилити приблизно п’ять крапель сафранину і залишити на одну хвилину. Після цього спробуйте обережно промити водою протягом п’яти секунд.
- Візуалізуйте зразок при збільшенні 1000X. Бактерії стануть фіолетовими або фіолетовими, якщо вони є грампозитивними, або рожевими, якщо грамнегативними через сафранину.
Спосіб 2 Виконайте тест на фарбування Зюля-Нельсена
- Використовуйте цю методику для виявлення кислотостійких бактерій. Ці види містять більшу кількість ліпідів, роблячи їх більш стійкими до барвників, використовуваних при фарбуванні Грамом. Кислостійкі бактерії належать до роду Mycobacterium, до складу якого входить бактерія, відповідальна за туберкульоз (M. tuberculosis). Для фарбування кислотостійкої бактерії потрібно використовувати червоний барвник під назвою карболовий фуксин, стійкий до полоскання кислими або сірчаними кислотними розчинами.
- Вживайте відповідних захисних заходів. Хімічні та біологічні матеріали, які використовуються під час фарбування Циля-Нельсена, можуть бути небезпечними. Крім того, вам також знадобиться використовувати джерела тепла, такі як насадка Bunsen, електричний нагрівач або алкогольна лампа. Дотримуйтесь інструкцій нижче, щоб виконати тест.
- Одягніть захисні окуляри, рукавички з нітрилу та лабораторне пальто.
- Будьте обережні, щоб не вдихати пари від барвників і відбілювачів, і не дозволяйте крапель бризкати вашим очам або шкірі. Тримайте контейнери відкритими під кришкою.
- Будьте дуже обережні, прогріваючи лезо. Більшість використовуваних хімічних речовин легкозаймисті. На гірках або іншому обладнанні також можуть бути сліди легкозаймистих речовин.
- Підготуйте лезо. Круговими рухами рівномірно розподіліть невелику кількість проби бактерій у центрі стерильної гірки. Ваш зразок повинен займати приблизно 10 мм на 20 мм.
- Висушіть лезо. Покладіть лезо на сушильну конструкцію зразком, зверненим вгору. Дайте йому висохнути природним шляхом протягом 30 секунд. Не намагайтеся сушити лезо тканиною.
- Закріпіть зразок теплом. Зразком вгору просуньте лезо два-три рази над запаленим пальником Bunsen. Ви також можете розмістити лезо на електронагрівачі, встановивши температуру між 65 ° C і 75 ° C принаймні на дві години. Будьте обережні, щоб зразок не закипав і не спалив.
- Додайте в лезо карболовий фуксин. На гірку вилийте кілька крапель цього розчину. Налийте достатньо, щоб повністю покрити зразок.
- Нагрійте лезо, щоб закріпити барвник. Просуньте гірку обережно над конфоркою Bunsen або алкогольною лампою, зразком, спрямованим вгору, або поставте його на електричний нагрівач. Нагрійте лезо до 60 ° C або до тих пір, поки воно не почне виділяти пар. Дайте барвнику діяти п’ять хвилин.
- Якщо ви використовуєте електронагрівач, увімкніть його при 60 ° C. Якщо ви виберете спиртову лампу або пальник Bunsen, вам слід сподіватися побачити пари.
- Щоб п’ять хвилин тримати лезо при бажаній температурі, періодично прогрівайте його.
- Будьте обережні, щоб зразок не закипав, не спалив і не висушив.
- Промийте лезо холодною водою. Дайте охолонути протягом п’яти хвилин і обережно промийте кілька секунд чистою водою. Використовуйте водопровідну воду або пляшку для віджимання, щоб видалити плями барвника, які не прилипали до зразка.
- Вилийте на зразок кислий спирт або сірчану кислоту. Для повного покриття зразка використовуйте 3% об. (Об. / Об.) Спирту або 20% сірчаної кислоти. Дайте кислоті працювати, поки колір не в’яне і не набуде дуже яскравого рожевого відтінку. Процес зазвичай займає близько десяти хвилин.
- Для промивання леза використовуйте чисту воду. Акуратно вимийте лезо під краном або за допомогою віджимаючої пляшки. Добре видаліть усі залишки кислоти та барвника.
- Додайте контрастну речовину. Після того, як ви промили гірку, вилийте на барвник малахітовий зелений або метиленовий синій. Ці два рішення створюють синюватий або зеленуватий фон, на якому вийде червоний барвник, а також інші біологічні матеріали, такі як клітини людини та некислостійкі бактерії. Нехай речовини працюють одну-дві хвилини.
- Промийте і висушіть лезо. Ретельно промийте водою, щоб видалити зайвий контраст. Після того, як ви закінчите, висушіть задню частину леза сухою тканиною і дайте їй висохнути природним чином на підставці.
- Візуалізуйте зразок при збільшенні 1000X. Кислостійкі бактерії стануть червоними або темно-рожевими. Інші бактерії, небактеріальні клітини та основа леза стануть зеленими або синіми.
Метод 3 Вивчення поведінки та зовнішнього вигляду бактерій
- Проаналізуйте форму бактерій. Провівши тест на фарбування, щоб визначити, чи є бактерії грампозитивними, грамонегативними чи кислотостійкими, настав час точніше визначити вид. Спочатку проаналізуйте форму бактерій на слайді. Три найпоширеніші форми - коки (кулясті), спіралі та бацили (стрижнева форма).
- Існує кілька варіантів цих форм. Наприклад, бактерії округлої форми (кокки) можуть з’являтися парами (диплококи), ланцюгами, купами або групами по чотири (тетради).
- З’ясуйте, чи є бактерії аеробними чи анаеробними. Візьміть два зразки бактерій і створіть дві окремі культури. Місяць повинен бути анаеробним (вирощений без кисню), а інший повинен бути аеробним (вирощений киснем). Зберігайте анаеробну культуру при температурі 35 ° C в безкисневому місці не менше 48 годин до спостереження за ростом.
- Якщо бактерії ростуть у середовищі без кисню, але не піддаються впливу кисню, це означає, що вони є анаеробними.
- Хоча вони розвиваються в кисневому середовищі, але не за браком кисню, вони є аеробними.
- Коли вони розвиваються в обох середовищах, ми говоримо про факультативні анаеробні бактерії.
- Виконайте тест на рухливість. Бактерія є рухливою, якщо вона може пересуватися самостійно з одним або кількома джгутиками. Ступінь рухливості дуже важливий при виявленні певних видів бактерій. Існує кілька видів моторики, але найбезпечнішим і розбірливим способом є напівтверде середовище.
- Створіть культуру для тесту на рухливість. Підготуйте культуру бактерій у бульйоні культури. Дотримуйтесь інструкцій нижче, щоб приготувати бульйон на ваш вибір.
- Культуру інокулюють напівтвердим агаром для випробувань на рухливість. Нанесіть частину культури бульйону стерильною голкою для щеплення. Обережно посадіть голку в напівтверду трубку дагара, наприклад, TAG-лагар, який ви підготували для тесту. Голка повинна проникати на 2/3 агару.
- Коли ви закінчите, обережно вийміть голку, стежачи за тим, щоб не перевищити межі зони щеплення.
- Інкубуйте пробірку при 30 ° С протягом 48 годин.
- Прочитайте результат тесту. Агар для тесту на рухливість стане червоним при контакті з бактеріями. Якщо вони рухливі, цей червоний або рожевий відтінок пошириться по всій речовині. В іншому випадку фарбування буде обмежено місцем уколу.
Спосіб 4 Інтерпретуйте всі результати
- Зберіть свої коментарі. Щоб знати вид бактерій, вам потрібно буде зібрати інформацію, отриману з культур, тестів на забарвлення та спостереження за формами. Якщо ви обстежуєте зразки пацієнта, симптоми, які вони мають, також можуть допомогти визначити, який тип бактерій є відповідним.
- Наприклад, якщо аналізи показують, що бактерії є грамнегативними, анаеробними, нерухливими і ви помічаєте у пацієнта такі симптоми, як біль у животі, нудота та блювота, цілком ймовірно, що пацієнт страждає на бактеріоїдну інфекцію. ламкі.
- Зверніться до бази даних. У світі існує тисячі видів бактерій. Навчити все напам’ять неможливо. Вам, ймовірно, доведеться звернутися до клінічної книги з мікробіології або в Інтернет-базі даних, щоб порівняти результати тестів з інформацією про види бактерій.
- Існують чудові інтернет-ресурси для ідентифікації бактерій, але більшість цих баз даних доступні англійською мовою, включаючи Patricbrc.org та GlobalRPh. Однак ви все ще можете знайти корисну інформацію на веб-сайті Міжнародного центру мікробних ресурсів INRA.
- Зробіть генетичний тест, щоб знати точні види бактерій. У деяких випадках може знадобитися ідентифікація видів бактерій. Найшвидший і найпростіший метод - це зробити тест на ДНК. ДНК-тести також корисні для виявлення бактерій, стійких до традиційних форм фарбування та культури. У наш час тести ДНК на мікроорганізми дуже швидкі і можуть бути готові менше ніж за дві години.
- Якщо у вас немає доступу до лабораторії, яка здійснює генетичне секвенування мікроорганізмів, направляйте бактеріальний зразок в спеціалізоване агентство.